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  5种合成siRNA分子方法及途径的比较


目前,实验人员都采用将siRNA分子导入细胞内的方法进行RNAi的研究。现在一共有5种合成siRNA分子方法及途径:
1. 化学合成。
2. 体外转录。
3.“鸡尾酒”法(RNaseIII酶切dsRNA)。
4. 质粒、病毒载体介导的siRNA体内表达。
5. siRNA表达框介导的siRNA体内表达。

   前三种方法都是在体外得到siRNA分子后,利用转染、电转化等方法直接将siRNA导入哺乳动物的细胞;后两种方法以载体与siRNA表达框为媒介,使siRNA分子在细胞内表达。实验人员可根据实验的目的与情况,选择具体方法进行实验。

   除RNaseIII酶切dsRNA的方法外,用上述其余4种方法合成siRNA之前都要根据目标基因设计特定的siRNA序列。如要得到1个效率高的siRNA,一般需要设计3~4个siRNA并在此基础上进行实验、筛选。

   为了帮助提高设计siRNA的效率,Cenix BioScience——Ambion的合作伙伴,开发出了专门用于设计siRNA的软件,可大大减少测试siRNA的数量,使研究人员能快速地得到高效率的siRNA。(详情www.ambion.com/siRNA)

一.化学合成
客户设计出siRNA序列后,由合成仪按照序列进行合成及后续的纯化。Ambion公司可根据客户的siRNA序列提供合成服务,也可使用Cenix BioScience的专业软件替客户设计序列后进行合成。
Ambion合成的siRNA产品都经过MALDI-TOF的检测,并提供相关的数据。其纯度分为3类:普通级(脱盐、脱保护,纯度大于80%),HPLC级(纯度大于97%),PAGE级(纯度大于97%)。
该方法的优点是得到的siRNA纯度高并且无需进行任何其他实验,但缺点是价格高昂。所以目前研究人员更多采用的方法是利用相对廉价的方法合成siRNA进行筛选,在确认高效率的siRNA后,再利用化学合成法合成siRNA进行实验。体外转录就是一种廉价的方法。

二.体外转录
   针对siRNA的序列合成对应的DNA链,再利用RNA聚合酶进行体外转录,转录产物即可导入细胞。Ambion的SilencerTM siRNA Construction Kit就是采用此类方法的试剂盒。
该方法的优点是价格便宜,试剂盒使用方便,但缺点是需要进行其他实验,且siRNA的合成量受到限制。

三.“鸡尾酒”法(RNaseIII酶切dsRNA)
   从一些siRNA序列中筛选出效率最高的1个siRNA分子是RNAi研究的一大瓶颈,针对这种情况,研究人员提出了一种称为“鸡尾酒”的siRNA制备方法。该方法是模仿了siRNA在体内的工作原理,其过程如下:首先针对靶基因的mRNA在体外转录合成长dsRNA;再用RNaseIII或Dicer对长dsRNA进行酶解,形式一组siRNAs的混合物;最后将该混合物导入细胞内。Ambion的SilencerTM siRNA Cocktail Kit就是采用此类方法的试剂盒。
该方法的优点是可以避开烦琐的siRNA设计与筛选工作,缺点是有可能产生非特异性基因的抑制,而且在有效地抑制基因表达后并不知道真正起作用的siRNA。

四.siRNA表达载体
   上面3种方法都是在体外得到siRNA后再导入细胞内,但是这种方法有两方面无法克服的缺点:siRNA进入细胞后容易被降解;进入细胞siRNA的数量不受控制。针对这种情况,出现了质粒、病毒类载体介导的siRNA体内表达。该方法的基本思路是:将siRNA对应的DNA双链序列克隆入载体内,位于RNA聚合酶III的启动子后,这样就能在体内表达所需的siRNA分子。
该方法的优点是使siRNA直接在体内得到表达,是用于RNAi长期研究的唯一方法。在载体上的抗性标记能帮助快速筛选出阳性克隆,目前包括Ambion在内的一些公司已开发出病毒类的载体(如腺病毒载体),这样就可使siRNA进入更多种类的细胞内进行研究。由于此方法涉及构建克隆,所以需要进行大量的实验,如构建克隆、序列测定等。现在Ambion公司能够提供10种质粒载体,其中带有不同的启动子与抗性标记,如小鼠的U6启动子、人的U6启动子、人的H1启动子,抗性标记有嘌呤霉素、新霉素、潮霉素。

五.siRNA表达框
siRNA表达框的本质是一段含有能表达siRNA分子的PCR产物,无需克隆入载体即可导入细胞抑制特定基因的表达。在表达框的上游含有RNA聚合酶III的启动子,在下游含有RNA聚合酶III的终止序列。siRNA表达框介导的siRNA表达也属于体内表达的方法,与siRNA表达载体相比其优点是无需克隆可直接导入细胞,但在表达框的两端加上酶切接头后也可克隆入载体,方便客户使用。Ambion公司的SilencerTM siRNA Expression Cassette Kit就是采用该方法的试剂盒。

比较项目 化学合成 体外转录

RNase III
降解dsRNA

质粒载体 腺病毒载体 逆转录病毒  载体

PCR
表达框

材料需求
21-mer RNA
oligos(一对)
29-mer DNA oligos(一对)
转录模版(200-000bp,两侧带T7 启动子)
55-60-merDNA oligos (一对)
 0
  0
~50-mer DNA oligos(一对
全部制备/ 合成时间 所需时间

4天—2周

24 小时 + DNA oligo合成时间

1 天 + 转录模版制备时间

5天以上 + DNA oligo合成时间

~ 6 小时+ DNA oligo合成时间

0
0

个人所需
操作时间

几乎不需要

中等

中等

中等

是否需要验证和寻找最有效siRNA

需要

需要

不需要

需要

需要

需要

需要

能否标记siRNA

不能

不能

不能

不能

转染的相对
难易程度

中等

很好

很差

可筛选性
(例如抗生素筛选)

不可以
不可以
不可以
可以
可以
可以
不可以

能否适用于长效抑制

不适用

不适用

不适用

不适用

不适用

适用

不适用

能否大规模制备

可以

有限

有限

可以

可以

可以

有限

检测总体转染效率

不可以

不可以

不可以

可以

可以

可以

不可以

每个基因的相对费用(不包含人力)

很高

中等

中等

中等

优点

方便,几乎无需研究人员工作

得到siRNAs的时间短

无需检测和筛选有效siRNA序列,较省钱

可以简单地大量制备

导入效率高,可感染静止期的细胞

RNAi效果可永久持续

得到siRNAs的时间非常短

缺点

费用高,定制周期长

实验规模受到限制

可能易引发非特异性沉默

RNAi效果持续时间短,导入效率低

RNAi效果持续时间短,制备病毒较费时间

不能感染静止期的细胞

很难转染

 

   
   
 
 
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